Page 54 - 《中国药房》2021年第9期
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对照组和干姜水煎液不同浓度组[0.125、0.25、0.5、1、2、 mg/mL 干姜水煎液的培养基 80 μL，继续培养 24 h。吸
4、8 mg/mL，以生药量计（下同），给药质量浓度根据预试 弃培养基，加入Seahorse XF基础培养基清洗3～4次后，
验结果设置]，另设不加细胞的空白组，每组设 6 个复 每孔均加入Seahorse XF基础培养基180 μL，继续培养1
孔。空白组、对照组加入 100 μL 培养基，干姜水煎液不 h 后，采用细胞能量代谢分析仪检测各组细胞在药物干
同浓度组加入含相应药物的培养基 100 μL，继续培养 预后0～50 min内的耗氧率、细胞外酸化率，并根据试剂
24 h。然后每孔加入 CCK-8 溶液 10 μL，继续培养 30 盒说明书相关方法计算基线耗氧率、基线细胞外酸化
min，采用酶标仪于 450 nm 波长下测定各孔吸光度值， 率、应激耗氧率和应激细胞外酸化率。
并计算细胞存活率[细胞存活率＝（OD 给药组－OD 空白组）/ 2.6 H9c2心肌细胞中线粒体能量代谢相关指标检测
（OD 对照组－OD 空白组 ）×100％]。 参考文献[22]方法和细胞线粒体压力检测试剂盒说
2.4 H9c2心肌细胞形态学观察及定量分析 明书的相关方法，采用细胞能量代谢分析仪进行检测。
参考文献[19－20]方法，采用高内涵筛选系统检 取对数生长期的 H9c2 心肌细胞，按“2.5”项下“按 6 000
测。取对数生长期的H9c2心肌细胞，按8 000个/孔接种 个/孔接种……继续培养1 h后”方法操作后，采用细胞线
于96孔板中，分为对照组、模型组和干姜水煎液低、中、 粒体压力检测试剂盒检测各组细胞在药物干预后 0～
高浓度组（0.125、0.25、0.5 mg/mL，给药质量浓度根据细
80 min内的耗氧率，并计算细胞耗氧率、基础呼吸水平、
胞存活率实验筛选结果设置），每组设置3个复孔。对照
+
最大呼吸水平、ATP产生水平、H 质子渗漏水平、备用呼
组和模型组细胞加入培养基100 μL，干姜水煎液各浓度
吸能力、非线粒体呼吸水平。
组细胞加入含相应药物的培养基 100 μL，于 37 ℃、5％
2.7 统计学方法
CO2的恒温培养箱中培养 2 h 后，吸弃培养基；对照组再
采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以x±s
加入新鲜培养基100 μL，模型组和干姜水煎液各浓度组
表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差
均加入含 5 μmol/L 阿霉素的培养基 100 μL，继续培养
异有统计学意义。
24 h。吸弃上清液，以PBS清洗2次后，每孔加入荧光染
3 结果
料混合液（由 Hoechst 33342 核酸染料、钙黄绿素活细胞
3.1 干姜水煎液对H9c2心肌细胞存活率的影响
染料和溴乙啡锭二聚体 1 死细胞染料按 50 ∶ 1 ∶ 7 体积比
与对照组比较，干姜水煎液0.125 mg/mL组细胞存活
配制而成）100 μL，避光静置 30 min 后，吸弃染料混合
率显著升高（P＜0.01），干姜水煎液1、2、4、8 mg/mL组细胞
液；以PBS清洗2次后，加入PBS适量，采用高内涵筛选
存活率均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），干姜水煎液0.25、
系统观察各组细胞形态（蓝色荧光表示所有细胞，绿色
0.5 mg/mL组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），
荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞），并进行定量分
详见图 1。基于此，后续选择 0.125、0.25、0.5 mg/mL 的
析。以对照组的细胞总数、活细胞荧光强度和死细胞荧
干姜水煎液研究其对H9c2心肌细胞形态学的影响。
光强度为参照，计算干姜水煎液不同浓度组和模型组细
胞的相对细胞总数（相对细胞总数＝给药组或模型组细 120 ＊＊
胞总数/对照组细胞总数×100％）、相对活细胞荧光强度 ＊
90 ＊＊
（相对活细胞荧光强度＝给药组或模型组活细胞荧光强 ％ ＊＊
度/对照组活细胞荧光强度×100％）和相对死细胞荧光 60 ＊＊
强度（相对死细胞荧光强度＝给药组或模型组死细胞荧 细胞存活率，
光强度/对照组死细胞荧光强度×100％）。 30
2.5 H9c2心肌细胞线粒体呼吸功能相关指标检测
参考文献[21]方法和细胞呼吸表型检测试剂盒说明 0
书的相关方法，采用细胞能量代谢分析仪检测。取对数 对照组
生长期的H9c2心肌细胞，按6 000个/孔接种于Seahorse 干姜水煎液0.25 mg/mL组 干姜水煎液0.5 mg/mL组 干姜水煎液1 mg/mL组 干姜水煎液2 mg/mL组 干姜水煎液4 mg/mL组 干姜水煎液8 mg/mL组
XFp细胞培养板中，于37 ℃、5％CO2的恒温培养箱中培 干姜水煎液0.125 mg/mL组
养24 h后，分为对照组、模型组和干姜水煎液0.5 mg/mL
组（给药质量浓度根据细胞存活率实验结果设置），每组
注：与对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
设置3个复孔。对照组和模型组中加入培养基80 μL，干 Note：vs. control group，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
姜水煎液0.5 mg/mL组加入含相应药液的培养基80 μL， 图 1 干姜水煎液对 H9c2 心肌细胞存活率的影响（x±±
继续培养2 h后，吸弃培养基；对照组再加入新鲜培养基 s，n＝6）
80 μL，模型组加入含 5 μmol/L 阿霉素的培养基 80 μL， Fig 1 Effects of ZOD on survival rate of H9c2 cardio-
干姜水煎液 0.5 mg/mL 组加入含 5 μmol/L 阿霉素和 0.5 myocytes（x±±s，n＝6）
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