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波长处测定其吸光度（OD），并计算各多糖组细胞的存 Trizol 试剂，反复吹打，使细胞充分裂解，按照试剂盒说
活率。各多糖组的细胞存活率＝[（OD 多糖组－OD 空白组）/ 明 书 操 作 提 取 总 mRNA。 采 用 分 光 光 度 计 测 定 总
（OD 对照组－OD 空白组）]×100％。试验重复 3 次。3 种多糖 mRNA 在 260、280 nm 波 长 处 的 吸 光 度（OD），根 据
作用24、48 h后的细胞存活率测定结果见表1。 OD260/OD280评价其纯度。然后取mRNA反转录合成cD-
表 1 3 种多糖作用 24、48 h 后的细胞存活率测定结果 NA后，在Mini Opticon 检测系统上进行PCR扩增。扩
TM
（x±±s，n＝3，％％） 增体系（20 μL）：qPCR 试剂 10 μL，上、下游引物（10
Tab 1 Survival rate of cells cultured with 3 kinds of μmol/L）各0.5 μL，双蒸水5.0 μL，cDNA模板4.0 μL。扩
polysaccharide for 24，48 h（x±±s，n＝3，％％） 增条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 10 s，62 ℃退火
质量浓度， CP组 CP1-2-1组 CP3-1-1组 30 s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环。以β-actin为内参，采
μg/mL 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 用 2 －ΔΔc t 法计算目的基因的表达水平。试验重复 3 次。
0.01 101.12±2.11 99.01±0.99 102.13±0.85 99.12±2.19 103.45±1.00 99.03±2.11
0.1 103.72±2.82 99.01±2.17 103.54±1.66 100.00±4.43 105.58±1.78 100.21±0.88 按照“2.3.2”项下方法进行统计分析。PCR 引物序列和
1 111.63±3.01 100.00±6.41 115.30±4.87 102.10±2.77 113.52±12.00 100.21±2.73 扩增产物长度见表 3，各组细胞中 TLR-4、NF-κB、IL-6、
10 115.01±8.99 103.54±8.01 115.00±1.01 106.00±7.23 119.51±7.89 106.84±4.99 TNF-α mRNA表达水平测定结果见表4。
100 119.80±9.90 105.51±2.78 124.30±3.14 114.00±1.99 119.33±10.09 107.63±4.48
表3 PCR引物序列和扩增产物长度
结果显示，0.01～100 μg/mL 的 3 种多糖在作用 24、
Tab 3 PCR primer sequence and amplified product
48 h 后，对细胞均无细胞毒性（细胞存活率均大于
length
99％），甚至还有一定的促细胞增殖作用。这提示党参
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp
多糖是一种天然无毒的生物大分子，可用于后续试验。
β-actin 上游：CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 110
2.3.2 党参多糖对 LPS 诱导细胞炎症的影响 取处于 下游：TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT
3
对数生长期的 RAW264.7 细胞，以 5×10 个/孔接种于 96 TLR4 上游：TGACTCCATTCAAGCCCAA 137
下游：CCAAGATCAACCGATGGAC
孔板中（每种多糖单独使用一块板），每孔100 μL。将细
NF-κB 上游：CACCAAAGACCCACCTCACC 239
胞分为空白组（空白培养基）、模型组（1 μg/mL LPS）和 下游：CCGCATTCAAGTCATAGTCCC
多糖低、中、高质量浓度组（1 μg/mL LPS+25、50、100 IL-6 上游：AGCCAGAGTCATTCAGAGCAAT 214
下游：CCGAGTAGACCTCATAGTGACCTTT
μg/mL 多糖溶液，多糖用 PBS 溶解），每组设 4 个复孔。
TNF-α 上游：TCAGCCTCTTCTCATTCCTGC 212
加药后，将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 24 h， 下游：CTCCTCCGCTTGGTGGTTT
收集细胞培养液，按照试剂盒说明书操作测定 NO 含 表 4 各组细胞中 TLR-4、NF-κB、IL-6、TNF-α mRNA
量。试验重复 3 次。采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统 表达水平测定结果（x±±s，n＝3）
计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素 Tab 4 mRNA expressions of TLR-4，NF-κ B，IL-6
方差分析，组间两两比较采用 t 检验，P＜0.05 表示差异 and TNF-α in cells in each group（x±±s，n＝3）
有统计学意义。各组细胞培养液中 NO 含量测定结果 考察样品 组别 TLR4 NF-κB IL-6 TNF-α
见表 2。 CP 空白组 1.01±0.16 1.02±0.10 1.00±0.10 1.02±0.08
模型组 1.58±0.10 ＊＊ 2.42±0.13 ＊＊ 1.50±0.08 ＊＊ 1.63±0.02 ＊＊
表 2 各组细胞培养液中 NO 含量测定结果（x±±s，
25 μg/mL组 1.30±0.15 2.06±0.22 1.32±0.18 1.40±0.03
n＝3） 50 μg/mL组 1.21±0.04 ## 1.52±0.08 ## 1.18±0.12 # 1.21±0.05 ##
Tab 2 Contents of NO in cell culture solution in each 100 μg/mL组 1.10±0.10 ## 1.29±0.14 ## 1.09±0.07 ## 1.12±0.12 ##
CP1-2-1 空白组 0.95±0.07 1.03±0.05 1.00±0.03 1.01±0.14
group（x±±s，n＝3）
模型组 1.38±0.07 ＊＊ 1.42±0.06 ＊＊ 1.36±0.09 ＊＊ 1.39±0.13 ＊
多糖 空白组 模型组 25 μg/mL 组 50 μg/mL组 100 μg/mL组 25 μg/mL组 1.12±0.06 # 1.19±0.03 ## 1.26±0.04 1.19±0.08
CP 101.36±19.21 389.46±14.56 ＊＊ 354.55±13.09 # 346.82±14.80 # 322.18±17.11 ## 50 μg/mL组 1.09±0.06 ## 1.17±0.05 ## 1.18±0.02 # 1.15±0.03 #
CP1-2-1 104.44±22.20 393.37±18.09 ＊＊ 327.78±10.89 ## 293.33±23.93 ## 273.34±12.34 ## 100 μg/mL组 0.98±0.01 ## 1.12±0.05 ## 1.07±0.08 # 1.06±0.04 #
CP3-1-1 100.00±10.09 397.73±23.99 ＊＊ 351.36±15.11 # 331.18±12.90 # 290.10±24.67 ## CP3-1-1 空白组 0.97±0.05 1.02±0.13 1.03±0.12 1.04±0.14
##
注：与空白组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜0.01 模型组 1.40±0.16 ＊ 1.40±0.12 ＊ 1.40±0.07 ＊＊ 1.40±0.13 ＊
＊＊
#
25 μg/mL组 1.21±0.07 1.22±0.06 1.19±0.10 # 1.21±0.09
＊＊
Note：vs. blank group， P＜0.01；vs. model group，P＜0.05，P＜
##
#
50 μg/mL组 1.12±0.11 1.13±0.11 # 1.11±0.10 # 1.14±0.06 #
0.01
100 μg/mL组 1.08±0.06 # 1.10±0.11 # 1.06±0.08 ## 1.08±0.10 #
结果显示，与空白组比较，模型组细胞培养液中NO
＊ ＊
#
＊
注：与空白组比较， P＜0.05， P＜0.01；与模型组比较，P＜
含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，3 种多糖组细
##
0.05，P＜0.01
胞培养液中NO含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。 Note：vs. blank group，P＜0.05， P＜0.01；vs. model group，P＜
#
＊
＊＊
2.3.3 3种多糖的抗炎机制研究 按“2.3.2”项下方法进 0.05，P＜0.01
##
行细胞接种、分组和给药。然后将细胞置于 37 ℃、5％ 结果显示，与空白组比较，模型组细胞中 TLR4、
CO2 培养箱中培养 24 h，用 PBS 快速清洗细胞，加入 NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平均显著升高（P＜
中国药房 2020年第31卷第11期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 ·1351 ·