Page 71 - 《中国药房》2023年17期
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和生理盐水；cGAS 抑制剂组大鼠鼻内滴注 450 μg/kg                    温封闭 1 h；加入 cGAS、STING、GAPDH（内参）一抗（稀
                                                [13]
          RU.521（以DMSO溶解后再以生理盐水稀释） ，并腹腔                      释比例分别为 1∶1 000、1∶400、1∶10 000），4 ℃孵育过
          注射等量DMSO和生理盐水；假手术组和TBI组大鼠均                         夜；次日洗涤后加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀
          分别腹腔注射和鼻内滴注等量DMSO和生理盐水；每隔                          释比例为 1∶20 000），室温孵育 1.5 h；化学发光试剂
          24 h给药1次，共给药4次（包括造模当天的给药）。                        （ECL）显色。扫描图像后用 Image J1.8.0 软件分析蛋白
          2.2 大鼠神经功能评估                                       条带灰度，以目的蛋白条带灰度值与内参（GAPDH）蛋
              采用改良神经功能缺损评分（modified neurological             白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
          severity scores，mNSS）法进行评估。在第 2、3 次和末次             2.8 统计学方法
          给药 2 h 后（即给药 1、2、3 d），采用 mNSS 法评估所有大                   实验数据应用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合
          鼠的神经功能（包括运动、反射、感觉和平衡功能4个项                          正态分布的数据以x ˉ± s表示，多组间比较采用单因素方
          目），0、1～6、7～12、13～18 分分别表示无、轻度、中度、                  差分析，组间多重比较采用 SNK-q 检验。检验水准
                          [14]
          重度神经功能障碍 。                                         α＝0.05。
          2.3 大鼠脑含水量测定                                       3 结果
              采用干/湿比重法测定。末次 mNSS 评分结束后每                      3.1 大鼠神经功能评估结果
          组随机抽取6只大鼠，麻醉后断头取脑，使用电子分析天                              给药 1、2、3 d 时，与假手术组比较，TBI 组大鼠
          平立即称定脑组织重量（即湿重），随后放入100 ℃烤箱                        mNSS 显著升高（P＜0.05）；与 TBI 组比较，Scu 低、高剂
          中烘烤 72 h，在此期间多次称重，直至恒重（即干重）。                       量组和 cGAS 抑制剂组大鼠 mNSS 均显著降低（P＜
          计算脑含水量：脑含水量（%）＝（湿重－干重）/湿重×                         0.05）；与 Scu 低剂量组比较，Scu 高剂量组和 cGAS 抑制
          100%。                                              剂组大鼠 mNSS 均显著降低（P＜0.05）；Scu 高剂量组和
          2.4 大鼠脑组织病理学变化观察                                   cGAS 抑制剂组大鼠 mNSS 比较，差异无统计学意义
              采用HE染色法进行观察。每组另随机抽取6只大                        （P＞0.05）。结果见表1。
          鼠，麻醉后断头取脑，将左侧损伤部位脑组织使用4%多                          表1 给药不同时间后各组大鼠的 mNSS 结果（x±s，
          聚甲醛固定24 h后脱水、透明、石蜡包埋和常规切片（厚                             n＝24，分）
          度4 µm）。切片脱蜡至水后依次进行苏木素、伊红染色，                         组别           给药1 d        给药2 d        给药3 d
          脱水、透明、封片后使用光学显微镜观察脑组织病理学                            假手术组          0            0            0
                                                              TBI组       12.75±0.84 a  11.83±0.84 a  10.92±0.75 a
          变化并拍照。                                              Scu低剂量组    10.29±0.76 b  9.38±0.68 b  8.50±0.54 b
          2.5 大鼠脑组织细胞凋亡观察                                     Scu高剂量组     7.08±0.58 bc  6.25±0.58 bc  5.33±0.40 bc
              采用TUNEL染色法进行观察。取“2.4”项下脑组织                      cGAS抑制剂组    7.54±0.62 bc  6.58±0.54 bc  5.63±0.35 bc
                                                              F           1 373.795    1 312.047    1 768.784
          石蜡切片，参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书，依                          P            ＜0.001       ＜0.001       ＜0.001
          次采用 TUNEL 反应混合液、DAPI 染色，封片后使用荧                        a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与TBI组比较，P＜0.05；c：与Scu低
          光显微镜观察并拍照。TUNEL 染色阳性细胞（即凋亡                         剂量组比较，P＜0.05。
          细胞）的核呈绿色荧光。每张切片中随机取6个视野，使                          3.2 大鼠脑含水量测定结果
          用 Image J 图像分析软件计数凋亡细胞和总细胞（结果                          与假手术组比较，TBI 组大鼠脑含水量显著升高
          取平均值），并计算脑组织细胞凋亡率：脑组织细胞凋亡                         （P＜0.05）；与TBI组比较，Scu低、高剂量组和cGAS抑制
          率（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。                              剂组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.05）；与Scu低剂量组
          2.6 大鼠脑组织中炎症因子含量测定                                 比较，Scu 高剂量组和 cGAS 抑制剂组大鼠脑含水量显
              每组另随机抽取 6 只大鼠，麻醉后断头取脑，采用                       著降低（P＜0.05）；Scu高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑
          ELISA法检测大鼠脑组织中炎症因子（IFN-β、CXCL10、                   含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。
          TNF-α、IL-6）含量，具体操作参照相应试剂盒说明书进                      3.3 大鼠脑组织病理学变化观察结果
          行。检测仪器为酶标仪（波长450 nm）。                                  假手术组大鼠脑组织无明显异常。与假手术组比
          2.7 大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达测定                         较，TBI组大鼠脑组织存在病理学损伤，具体表现为：大
              采用 Western blot 法进行检测。将每组剩余的 6 只               量炎症细胞（包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞等）浸润，间
          大鼠麻醉后断头取脑，将左侧损伤部位脑组织使用                             质水肿，明显出血，细胞排列不规则、结构模糊且出现核
          RIPA裂解液裂解，提取组织中总蛋白，测定蛋白浓度后                         固缩和核裂解。与 TBI 组比较，Scu 低、高剂量组和
          进行变性，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶                           cGAS抑制剂组大鼠上述组织病理学损伤均有不同程度
          电泳进行分离，接着将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯                           改善，且以 Scu 高剂量组和 cGAS 抑制剂组大鼠改善更
         （polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以5%脱脂奶粉室           明显。结果见图1。


          中国药房  2023年第34卷第17期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17    · 2109 ·
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