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IRE1α）活化，进而激活凋亡信号调节激酶 1（apoptosis 1.3 实验动物
signal-regulating kinase 1，ASK1）和氨基末端蛋白激酶 糖尿病KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠均为10～12周
（c-Jun N-terminal kinase，JNK），最终导致细胞凋亡 [4―5] 。 龄，SPF级，雄性，购自北京华阜康生物科技有限公司，生
中医并无病名与 DCM 相对应，一般将其归为“消 产许可证号均为 SCXK（京）2019-0008。本实验已通过
渴”“心悸”“胸痹”“真心痛”等范畴。研究表明，当归多 甘肃中医药大学动物实验伦理会审查（编号2021-368）。
糖具有降糖、降脂、抗氧化、保护心脏、免疫调节等作 2 方法
用 。本研究通过 IRE1/ASK1/JNK 信号通路探讨了当 2.1 建模、分组与采样
[6]
归多糖对糖尿病KK-Ay小鼠心肌细胞凋亡的影响，旨在 所有小鼠均适应性喂养 1 周。C57BL/6J 小鼠喂养
为当归多糖的临床应用提供依据。 普通饲料，随机取8只为空白组。糖尿病KK-Ay小鼠喂
1 材料 养高脂高糖饲料，测得平均随机血糖≥13.9 mmol/L后，
1.1 主要仪器 随机分为模型组、二甲双胍组（200 mg/kg ）和当归多糖
[7]
本研究所用主要仪器包括 7080 型全自动生化分析 高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg ），每组 8 只。各
[8]
仪（日本Hitachi公司）、101-1AB型台式电热恒温鼓风干
组小鼠灌胃相应药液或生理盐水，每日1次，连续4周。
燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、DYCZ-40G型转印 末次灌胃后，各组小鼠心脏采血，分离血清，于－20 ℃保
电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、5424R型高速冷
存；分离心脏，取部分心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中
冻离心机（德国 Eppendorf 公司）、iMark 型酶标仪（美国
固定，另一部分心肌组织置于液氮储存。
Bio Rad 公司）、DW-HL528 型超低温冰箱（中科美菱低
2.2 生化指标检测
温科技股份有限公司）、DM2500型显微镜（德国Leica公
采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中空腹
司）等。
血糖、TC、LDL-C含量以及INS水平。
1.2 药品与试剂
2.3 心肌细胞凋亡率检测
当归多糖（批号 CY210714，纯度 98.14%）购自杨凌
取各组小鼠的心肌组织，石蜡包埋切片，室温梯度
慈缘生物技术有限公司；盐酸二甲双胍缓释片（批号
脱水，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，用TUNEL工
H20123024，规格0.5 g/片）购自河北山姆士药业有限公司；
作液孵育和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后，采
小鼠胰岛素（insulin，INS）ELISA 试剂盒（批号 202205）、
用显微镜观察并采集图片。采用Image J软件分析蓝色
低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，
或绿色阳性表达的平均光密度（average optical density，
LDL-C）含量测定试剂盒（批号CD20220527K）、总胆固醇
AOD）值，用以评价小鼠心肌细胞的凋亡率。
（total cholesterol，TC）含量测定试剂盒（批号CD202205-
2.4 心肌组织中ASK1、p-JNK、p-IRE1α蛋白表达检测
26K）均购自上海酶联生物科技有限公司；预染 Marker
采用免疫组化法进行检测。取各组小鼠的心肌组
试剂（批号 01011775）购自美国 Thermo Fisher Scientific
织，石蜡包埋切片、复水、修复抗原、封闭、孵育抗体、脱
公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号20191022）购自北京索
水、封片后，采用显微镜观察并采集图片。采用Image J
莱宝科技有限公司；兔B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma
软件分析棕黄色或棕褐色阳性表达的 AOD 值，用以评
2，Bcl-2）、磷 酸 化 IRE1α（pho-sphorylated IRE1α，p-
IRE1α）单 克 隆 抗 体（批 号 分 别 为 BA01167674、BS- 价ASK1、p-JNK、p-IRE1α蛋白的表达水平。
2.5 心肌组织中Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表达检测
16698R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔活化
的胱天蛋白酶（cleaved-caspase-3）单克隆抗体（批号 采用Western blot法进行检测。取各组小鼠0.1 g心
M12202117）购自沈阳万类生物科技有限公司；兔甘油 肌组织，放入 1.5 mL 的 EP 管中，经裂解、匀浆、离心、蛋
醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-pho-sphate dehydro‐ 白定量、变性、电泳、封闭后，抗体孵育（一抗 cleaved-
genase，GAPDH）单克隆抗体（批号 GR303514-13）购自 caspase-3、Bcl-2 的稀释比均为 1∶1 000，GAPDH 的稀释
美国 Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔 IgG 比为 1∶5 000；二抗稀释比为 1∶5 000），ECL 曝光条带。
二抗（批号 CR2102123）购自武汉赛维尔生物科技有限 利用Image J软件分析蛋白质条带的灰度值，以GAPDH
公司；兔磷酸化 JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）单克 为内参分析目标蛋白的表达量，再以空白组为标准进行
隆抗体（批号 BST17414380）购自武汉博士德生物工程 归一化处理。
有限公司；兔ASK1单克隆抗体（批号29r3489）购自美国 2.6 统计学分析
Affinity 抗体公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（批号 采用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验数据以x±
40306ES50）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；其 s 表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分
余试剂均为分析纯或实验室常用规格。 析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
· 1212 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 10 中国药房 2023年第34卷第10期
