Page 88 - 《中国药房》2026年6期
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并采用关节炎指数（arthritis index，AI）对大鼠关节病变                 为1∶5 000），于室温下孵育2 h；洗膜后，进行ECL显影、
          程度进行系统评估，当 AI 评分≥4 分时，判定诱导性关                        成像，并通过Image J软件分析各蛋白条带的灰度值，以
                          [6]
          节炎模型构建成功 。                                          目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示各目
              将造模成功的大鼠（造模成功率达100%）随机分为                        的蛋白的表达水平，以LC3 Ⅱ与LC3 Ⅰ、p-JAK3与JAK3、
                                                     [7]
          模型组，高良姜素低、中、高剂量组（1、5、15 mg/kg ）和                    p-STAT3 与 STAT3 的蛋白表达比值表示 LC3 的表达水
                                     [8]
          甲氨蝶呤组（阳性对照，2 mg/kg ），每组 10 只。自加强                    平和JAK3、STAT3的磷酸化水平。
          免疫后1周（即造模第15天）起，各药物组大鼠灌胃相应                             （2）免疫荧光染色实验：取“2.5”项下各组大鼠的踝
          药液，正常组和模型组大鼠灌胃等体积含 0.5% 吐温 80                       关节滑膜组织切片，经脱蜡、水化后，浸入 3%H2O2溶液
          的生理盐水，每天1次，连续28 d。                                  孵育，再以柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复；用山羊血清
          2.2 大鼠AI评分和足跖趾容积检测                                  封闭30 min后，加入LC3一抗（稀释比例为1∶1 000），于
                                                                                                  ®
              比较各组大鼠灌胃前（0 d）以及灌胃后7、14、21、28                   4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入 Alexa Fluor  594 鬼笔环
          d的AI评分和足跖趾容积。AI评分标准如下：正常无红                          肽（稀释比例为1∶5 000），于37 ℃下孵育1 h；洗膜后，用
          肿，记 0 分；足跖轻微肿胀/红斑，记 1 分；踝足泛红伴肿                      4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色 10 min，再以抗荧
          胀，记2分；中度肿胀/红斑，记3分；后爪严重肿胀/红斑，                        光淬灭剂终止反应，封片后，用倒置显微镜观察，并使用
                                              [6]
          记4分；计算四肢评分总和，最高分为16分 。采用足容                          Image J分析LC3阳性区域（呈红色）的荧光强度。
          积排水法对各组大鼠踝关节及以下部位（含踝关节）的                            2.7 统计学方法
          体积进行测定，并计算足跖趾容积：足跖趾容积＝（造模                               采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。所有计
          后容积－造模前容积）/造模前容积×100%。                              量数据均服从正态分布且方差齐，以 x±s 表示，多组间
          2.3 取材                                              比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q
              末次给药后24 h，将大鼠以腹腔注射戊巴比妥钠的                        检验。检验水平α＝0.05。
          方式进行麻醉，采集腹主动脉血1 mL。随后，处死各组                          3 结果
          大鼠，取其踝关节滑膜组织，一部分于4%多聚甲醛溶液                           3.1 高良姜素对模型大鼠AI评分和足跖趾容积的影响
          中固定，另一部分于－80 ℃下保存。                                      与正常组相比，模型组大鼠的AI评分和足跖趾容积
          2.4 大鼠血清中炎症因子水平检测                                   均普遍升高；与模型组相比，各药物组的AI评分和足跖
              取“2.3”项下各组大鼠血液样品，于室温下静置 2 h                     趾容积均普遍降低，且高良姜素的作用具有剂量依赖性
          后，在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 10 min，取上层血清，按            （P＜0.05），详细变化趋势见表1、表2。
          ELISA试剂盒说明书方法操作，以全功能酶标仪检测血                              表1 各组大鼠AI评分比较（x±s，n＝10，分）
          清中IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10水平。                          组别          0 d     7 d    14 d    21 d    28 d
          2.5 大鼠踝关节滑膜组织病理形态观察                                 正常组         0       0       0      0       0
              取“2.3”项下各组大鼠经4%多聚甲醛溶液固定48 h                     模型组       12.63±0.76 a  13.25±1.33 a  12.59±0.89 a  13.16±1.20 a  12.74±0.93 a
                                                              高良姜素低剂量组  13.33±0.97  12.43±0.73  11.43±1.16 b  10.38±1.01 b  9.72±0.69 b
          的踝关节滑膜组织，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡
                                                              高良姜素中剂量组  12.08±0.85  11.76±0.94 b  10.59±0.92 b  9.32±0.71 bc  8.16±0.38 bc
          包埋后切片；取切片适量，进行苏木精-伊红（HE）染色，                         高良姜素高剂量组  13.19±0.96  11.01±0.98 b  9.87±0.77 b  8.10±0.59 bcd  6.20±0.74 bcd
          于显微镜下观察其踝关节滑膜组织的病理变化。                               甲氨蝶呤组     12.79±0.86  11.33±1.02 b  9.95±0.65 b  7.75±0.69 b  6.32±0.57 b
          2.6 大鼠踝关节滑膜组织中相关蛋白表达检测                                 a：与正常组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与高良姜
                                                              素低剂量组相比，P＜0.05；d：与高良姜素中剂量组相比，P＜0.05。
              采用 Western blot 和免疫荧光实验对各组大鼠踝关
                                                                 表2 各组大鼠足跖趾容积比较（x±s，n＝10，%%）
          节 滑 膜 组 织 中 细 胞 自 噬 相 关 蛋 白（ULK1、Beclin-1、
                                                              组别          0 d    7 d     14 d    21 d   28 d
          LC3）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、caspase-3）和通路相关
                                                              正常组       0.14±0.02  0.15±0.03  0.16±0.01  0.17±0.02  0.19±0.02
          蛋白（JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3）的表达情况进行                模型组       0.65±0.04 a  0.74±0.05 a  0.79±0.04 a  0.69±0.05 a  0.67±0.03 a
          检测。                                                 高良姜素低剂量组  0.66±0.02  0.64±0.03 b  0.60±0.02 b  0.52±0.03 b  0.42±0.02 b
                                                              高良姜素中剂量组  0.65±0.03  0.58±0.02 bc  0.50±0.03 bc  0.41±0.02 bc  0.33±0.02 bc
             （1）Western blot实验：取“2.3”项下各组大鼠冻存的
                                                              高良姜素高剂量组  0.64±0.04  0.47±0.03 bcd  0.35±0.02 bcd  0.29±0.01 bcd  0.23±0.01 bcd
          踝关节滑膜组织适量，以 RIPA 裂解液裂解 30 min 后离                    甲氨蝶呤组     0.65±0.03  0.48±0.02 b  0.36±0.02 b  0.28±0.03 b  0.22±0.02 b
          心，收集上清液，测定总蛋白浓度并煮沸变性；取变性蛋                              a：与正常组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与高良姜
          白，经电泳分离后转膜，再以5%脱脂牛奶于室温下封闭                           素低剂量组相比，P＜0.05；d：与高良姜素中剂量组相比，P＜0.05。
          1 h；洗膜后，加入 ULK1、Beclin-1、LC3、Bax、Bcl-2、cas‐         3.2 高良姜素对模型大鼠血清中炎症因子水平的影响
          pase-3、JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、GAPDH 一 抗              与正常组相比，模型组大鼠血清中 IL-6、TNF-α 水
         （稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加                      平均显著升高，IL-4、IL-10 水平均显著降低（P＜0.05）；
          入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例                           与模型组相比，各药物组大鼠血清中 IL-6、TNF-α 水平


          · 766 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 6                               中国药房  2026年第37卷第6期
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