Page 63 - 《中国药房》2024年22期
P. 63

度 23～25 ℃、相对湿度 65%～70% 的条件下饲养。本                    于630 nm波长处检测EB含量（EB含量越高说明胎盘通
          研究方案通过南阳医学高等专科学校医学伦理委员会                            透性越高）。
          批准（编号 2023-伦审-049）。45% 高脂高糖饲料（定制）                  2.5 雌鼠胎盘组织病理变化观察
          和普通饲料（货号1010088）均购自江苏省协同医药生物                           取剩余15只雌鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg
          工程有限责任公司。                                          麻醉后处死，剖开腹部并分离胎盘，从每组中随机选取5
          2 方法                                               个胎盘固定于4%多聚甲醛中，剩余胎盘冻存于－80 ℃
          2.1 GDM模型建立                                        备用。取固定24 h后的各组雌鼠胎盘组织适量，以石蜡

              在雌鼠中随机选取20只作为对照组，以正常饲料喂                        包埋后连续切片（厚约4 μm），经二甲苯脱蜡、梯度乙醇
                                  [8]
          养。剩余雌鼠按照相关文献 方法以高脂高糖饲料喂养                           水化后，依次进行HE染色、PBS清洗、乙醇水化、二甲苯
          8 周后，禁食 12 h，剔除体重＜150 g 或＞180 g 且血糖高               透明，再用中性树脂封片，在光学显微镜下观察胎盘组
          于 7 mmol/L 的雌鼠；随后，将处于发情期的雌鼠与雄鼠                     织的病理变化。
          大致按2∶1的比例合笼交配，次日若观察到精子（以显微                         2.6 雌鼠胎盘组织中 SOD 活性及 MDA、GSH 含量
          镜观察阴道分泌物样品）或阴道黏液栓（肉眼观察即                            检测
          可），则判定该雌鼠怀孕。禁食 12 h 后，通过腹腔注射                           取“2.5”项下冻存的雌鼠胎盘组织（从每组中随机选
          35 mg/kg 的 STZ 来诱导怀孕雌鼠发生 GDM。注射 72 h               取另 5 个），以 PBS 匀浆，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心
          后，检测其空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），若             10 min，收集上清液，按相应检测试剂盒说明书操作，使
          FBG≥13.5 mmol/L，则表示 GDM 模型构建成功。造模                  用微量法以酶标仪测定SOD活性及MDA、GSH含量。
          过程中，3只雌鼠死亡，100只雌鼠成功构建GDM模型。                        2.7 雌鼠胎盘组织中 Shh、Ptch1、Smo、Gli1 蛋白表达
          2.2 分组与给药                                          检测
              将造模成功的雌鼠随机分为模型组、SAG组（Hh信                           采用Western blot法检测。取“2.5”项下冻存的雌鼠
          号通路激活剂）、Lut低剂量组、Lut高剂量组、Lut高+ITR                   胎盘组织（取每组剩余的 5 个），加 RIPA 蛋白裂解液匀
          组（Lut 高剂量+Hh 信号通路拮抗剂），每组 20 只。SAG                  浆，以 12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，用 BCA 法
                                                    [9]
          组雌鼠灌胃50 mg/kg的SAG（以生理盐水为溶剂） ；Lut                   测定蛋白浓度，并将蛋白煮沸变性。取变性蛋白适量，
          低、高剂量组雌鼠分别为灌胃 40、80 mg/kg 的 Lut（以生                 进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并
                       [5]
          理盐水为溶剂） ；Lut 高+ITR 组雌鼠依次灌胃 80 mg/kg                转移到聚偏二氟乙烯膜上，以 5% 脱脂牛奶在室温下封
          的Lut和50 mg/kg的ITR（均以生理盐水为溶剂） ；对照                   闭 1 h；洗膜后，加入 Shh、Ptch1、Smo、Gli1、β-actin 一抗
                                                  [10]
          组和模型组雌鼠灌胃等体积生理盐水。各组雌鼠灌胃                           （稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶300、1∶1 000、
          均为每天 1 次，持续 19 d，在此过程中所有雌鼠均未                       1∶ 1 000），在 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗
          分娩。                                               （稀释比例为1∶500），在室温下孵育2 h；洗膜后，用ECL
          2.3 雌鼠血清中 FBG、FINS 水平检测和胰岛素抵抗指                     化学发光试剂显色，并置于成像系统下成像。以β-actin
          数计算                                                为内参，使用Image J软件分析各目的蛋白的表达水平。
              末次给药结束后，各组雌鼠禁食、禁水12 h，采集其                      2.8 统计学方法
          空腹尾静脉血适量，置于 2 mL 离心管中，于 4 ℃下以                          采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数
          3 000 r/min离心10 min，收集上层血清。采用血糖仪检测                 据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两
          其FBG水平，采用ELISA法以酶标仪检测其FINS水平，                      多重比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          按下式计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：HOMA-IR＝                     3 结果
          FBG×FINS÷22.5 。                                    3.1 各组雌鼠血清FBG、FINS水平及HOMA-IR比较
                         [8]
          2.4 雌鼠胎盘质量及通透性检测                                       与 对 照 组 相 比 ，模 型 组 雌 鼠 FBG、FINS 水 平 及
              采血结束后，从每组雌鼠中随机选取5只，尾静脉注                        HOMA-IR 均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，SAG
          射 10 mL/mg 的 EB 染色液[以 20% 磷酸盐缓冲液（PBS）              组和Lut低、高剂量组雌鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR
          配制，终质量浓度为5 mg/L]，45 min后处死，剖开腹部并                   均显著降低（P＜0.05），且Lut高剂量组上述指标与SAG
          分离胎盘，称重；将胎盘放入甲酰胺溶液 1 mL 中，于                        组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。与 SAG 组和
          55 ℃下孵育 24 h 以提取 EB；随后，取上述溶液于 4 ℃                  Lut高剂量组相比，Lut高+ITR组雌鼠FBG、FINS水平及
          下以 12 000 r/min离心30 min，收集上清液，使用酶标仪                HOMA-IR均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。


          中国药房  2024年第35卷第22期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 22    · 2765 ·
   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68