Page 50 - 《中国药房》2024年22期

胃生理盐水+腹腔注射二甲基亚砜（体积及频次分别等 于冰上裂解 30 min；以 15 000 r/min 离心 30 min，收集上
同于灌胃或腹腔注射药液的体积及频次）外，石淋清颗 清液，以BCA试剂盒检测蛋白浓度后，加入上样缓冲液
粒低、中、高剂量组大鼠分别灌胃 6.5、13、26 g/kg（以生 适量，经变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶
药量计；低剂量为临床等效剂量，据《中药药理研究方法 电泳分离，转膜后以5%脱脂牛奶在常温下封闭30 min；
学》按体表面积折算而得，中、高剂量分别为低剂量的2、 加入 SIRT1、NLRP3、NF-κB、GAPDH 一抗（稀释比例分
4倍），每天1次，连续4周+腹腔注射二甲基亚砜（体积等 别为1∶1 000、1∶500、1∶2 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育过
同于腹腔注射SIRT1抑制剂的体积），每2天1次，连续4 夜；以 TBST 缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
周；石淋清颗粒高剂量+抑制剂组大鼠在同法灌胃石淋 1∶5 000），于室温下孵育 30 min；以 TBST 缓冲液洗膜
清颗粒26 g/kg的基础上，腹腔注射SIRT1抑制剂尼克酰 后，采用 ECL 法显色，再于凝胶图像分析仪下成像。采
胺5 mg/kg（以二甲基亚砜为溶剂，剂量根据预实验结果 用 Image J 图像分析软件进行定量分析，以目的蛋白与
设置），每2天1次，连续4周。 内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的相对
2.3 大鼠体重及肾脏指数测定 表达量。
末次给药后，称定各组大鼠体重，采尿采血后将大
2.9 统计学方法
鼠放在冰块上，充分暴露并摘取其左右肾脏，称定肾脏
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。符合正
质量，并计算肾脏指数：肾脏指数（mg/g）＝肾质量（mg）/
态分布的计量资料以x±s表示，多组间的比较采用单因
体重（g）。
素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。检验水
2.4 大鼠尿液、血清生化指标测定
准α＝0.05。
末次给药前 1 d，所有大鼠禁食、不禁水，用代谢笼
收集其24 h尿液，测定其24 h尿量及尿液pH值后，取部 3 结果
3.1 各组大鼠体重及肾脏指数比较
分尿液样品，采用全自动生化分析仪测定其尿液中钙离
与对照组相比，模型组大鼠的体重显著降低，肾脏
2+
子（Ca ）含量。另取部分尿液样品，采用铬酸钾氧化甲
基红催化光度法以离子色谱仪检测其尿液中草酸（oxa- 指数显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，石淋清颗粒各
剂量组大鼠体重均显著升高，肾脏指数均显著降低（P＜
lic acid，Ox）含量。
0.05）；与石淋清颗粒高剂量组相比，石淋清颗粒高剂
末次给药后，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，于
腹主动脉采血，静置 2～3 h 后，取部分以 3 000 r/min 离 量+抑制剂组大鼠的体重显著降低，肾脏指数显著升高
心 10 min；取上层血清样品适量，使用全自动生化分析 （P＜0.05）。结果见表1。
仪 检 测 其 血 肌 酐（serum creatinine，Scr）、血 尿 素 氮 表1 各组大鼠体重及肾脏指数比较（x±s，n＝10）
2+
（blood urea nitrogen，BUN）、血Ca 含量。 组别 体重/g 肾脏指数/（mg/g）
2.5 大鼠血清中炎症指标检测 对照组 311.03±20.11 9.30±0.45
模型组 210.50±13.17 a 15.18±0.62 a
采用 ELISA 法检测。取“2.4”项下各组大鼠血清样 石淋清颗粒低剂量组 241.65±8.30 b 13.71±0.28 b
品适量，参照相应试剂盒说明书方法，以酶标仪于 450 石淋清颗粒中剂量组 260.59±18.83 b 12.25±0.41 b
nm波长下检测其血清炎症指标（IL-1β、IL-18）水平。 石淋清颗粒高剂量组 279.18±13.88 b 11.35±0.52 b
石淋清颗粒高剂量+抑制剂组 253.95±37.61 c 14.64±0.67 c
2.6 大鼠肾组织病理变化观察
a：与对照组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与石淋清
采用HE染色法观察。取血后，取“2.3”项下各组大
颗粒高剂量组相比，P＜0.05。
鼠部分肾组织，用4%多聚甲醛固定24 h后，采用石蜡包
3.2 各组大鼠尿液、血清生化指标比较
埋法制作组织蜡块，并切片（厚度约5 μm），然后进行HE
与对照组相比，模型组大鼠 24 h 尿量和尿 pH 均显
染色，在显微镜下观察大鼠肾组织的病理变化。
著降低，尿Ca 和尿Ox含量均显著升高（P＜0.05）；与模
2+
2.7 大鼠肾组织草酸钙结晶情况观察
采用Von Kossa染色法观察。取“2.6”项下各组大鼠 型组相比，石淋清颗粒各剂量组大鼠 24 h 尿量和尿 pH
2+
的肾组织切片，经Von Kossa染色后，在显微镜下观察各 均显著升高，尿Ca 和尿Ox含量均显著降低（P＜0.05）；
组大鼠的草酸钙结晶（呈深棕色）情况并进行结晶评分。 与石淋清颗粒高剂量组相比，石淋清颗粒高剂量+抑制
2+
具体评分标准如下：无任何结晶存在，记0分；有散在结 剂组大鼠 24 h 尿量和尿 pH 均显著降低，尿 Ca 和尿 Ox
晶存在，记 1 分；结晶广泛不堆积或呈局限性存在，记 2 含量均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。
2+
分；结晶成堆但不连结，记3分；结晶成堆且互相连结，记 与对照组相比，模型组大鼠血清中BUN、Scr、Ca 含
4分；结晶广泛成堆且连结成片，记5分 。 量均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，石淋清颗粒各
[10]
2+
2.8 大鼠肾组织中 SIRT1、NLRP3、NF-κB 蛋白表达 剂量组大鼠血清中 BUN、Scr、Ca 含量均显著降低（P＜
检测 0.05）；与石淋清颗粒高剂量组相比，石淋清颗粒高剂
2+
采用Western blot法检测。取“2.6”项下各组大鼠的 量+抑制剂组大鼠血清中BUN、Scr、Ca 含量均显著升高
肾组织适量，加入裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸抑制剂， （P＜0.05）。结果见表3。

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